| | 08.09.2021

Скорость мутации относится к вероятности того, что единица длины ДНК (обычно пара оснований) мутирует со временем. Анализ флуктуаций или анализы накопления мутантов, применяемые к фенотипическим изменениям, измеряют скорость мутаций клеток. Однако известно лишь несколько фенотипических изменений, указывающих на мутации, что ограничивает анализ этими редкими генами. Прямое секвенирование преодолевает ограничения, налагаемые фенотипическим анализом, но ограничивается большим количеством клонов или клеток, которые необходимо анализировать в анализах флуктуации или накопления мутантов. Мы предлагаем стратегию определения скорости мутации гена путем ограниченного прямого секвенирования нескольких отдельных клеток определенного происхождения. Для этого мы определили среднее количество мутаций на позицию в каждой длине ДНК, секвенированной из доли немутантных положений,согласно процессу Пуассона и / или ряду Тейлора. Измерение скорости мутации путем прямого секвенирования генов не требует установления фенотипа и может применяться к любой области генома в клетке. Такой подход позволяет избежать ошибок флуктуации.

ВСТУПЛЕНИЕ

Мутации - это изменения нуклеотидной последовательности ДНК. Такие изменения могут быть точечными, т.е. ограничиваться одной парой оснований, или включать несколько пар оснований, включая делецию, добавление, амплификацию и рекомбинацию. Скорость мутации - это вероятность того, что данная пара оснований или более крупный участок ДНК изменяется со временем. Из практических соображений мутации обычно обнаруживаются по изменениям фенотипа в единицу времени, обозначенным как поколения клеток (1) или дни (2). Для целей этой рукописи мы будем рассматривать только точечные изменения при определении частоты мутаций.

Частота мутаций стабильных геномов оценивается в 10 -10 пар оснований на одно поколение клеток (3). Однако в определенных физиологических условиях скорость мутации резко возрастает. Например, гены иммуноглобулинов (Ig) могут подвергаться мутации со скоростью, превышающей базальную скорость более чем в миллион раз (1,4,5). В другом примере трансген lac I у мышей (у трансгенных мышей «Big Blue») претерпевает мутации чаще, чем ожидалось, исходя из базовой скорости мутаций (6,7). Считается, что раковые клетки мутируют с высокой скоростью. Однако вопрос о том, вызывают ли мутаторы рак исключительно из-за фенотипических проявлений мутаций, остается спорным (8).Неизвестно, изменяется ли скорость мутации при определенных физиологических условиях или в ответ на определенные стимулы, отчасти из-за трудностей изучения мутаций в клеточных клонах с течением времени. Следовательно, определение того, лежит ли скорость мутации в физиологических или патофизиологических состояниях, требует надежных и осуществимых подходов для измерения скорости мутации.

Скорость мутации в организмах или клетках может быть определена с помощью анализа флуктуаций или анализов накопления мутаций. Лурия и Дельбрюк изобрели флуктуационный анализ (9), чтобы определить, приобретают ли бактерии устойчивость к вирусной инфекции в результате спонтанной мутации. Скорость мутации у бактерий не может быть определена простым подсчетом непосредственно резистентных организмов, потому что это число может отражать потомство одного мутанта или, альтернативно, позднее возникновение многих независимых мутаций. Чтобы преодолеть эту проблему, Луриа и Дельбрюк определили среднее количество мутаций на культуру, построив график частоты культур, не содержащих устойчивых бактерий, в уравнении, описывающем нулевой порядок процесса Пуассона. Вероятность того, что в каждой культуре произошло ноль мутаций, снижает пуассоновский процесс доP (0) = e −λ, где λ - среднее количество мутаций на культуру (9). Частоту мутаций получали путем деления среднего количества мутаций на культуру на общее количество бактерий на поколение клеток (9). Ли и Коулсон (10), Сандри и Саркар (11,12) и Чжэн (13) добавили статистический анализ к применению флуктуационных анализов у ​​бактерий.

Wabl et al. (1) применили флуктуационный анализ для определения скорости мутации генов иммуноглобулинов в мышиных В-клетках. Wabl et al. (1) определили скорость реверсии янтарного кодона STOP в вариабельном экзоне тяжелой цепи иммуноглобулина в В-клетках. Анализ флуктуации применяли к клонам, выращенным из одиночных или очень немногих клеток в анализе компартментализации. Средняя частота мутации (λ) на клетку определялась нулевым порядком процесса Пуассона, согласно e −λ = N 0 / N. Скорость мутации рассчитывалась путем деления средней частоты мутации на расчетное количество поколений, прошедших во время роста клона, и давала 1,1 - 4,2 × 10 -5 на пару оснований на поколение клеток (1). Скорость мутации генов иммуноглобулинов в В-клетках была независимо подтверждена Zhu и соавторами (14). Эта высокая скорость мутации, примерно в миллион раз превышающая базовую скорость мутации, была названа «гипермутацией» (1) и обеспечила механизм наблюдаемой соматической диверсификации генов Ig (15,16). Подход, используемый для определения скорости мутации в локусах иммуноглобулина, обычно не применим, поскольку он применяется к определенному локусу с фенотипическим маркером мутаций.

Скорость мутации также можно определить с помощью анализов «накопления мутантов». В анализах «накопления мутантов» скорость мутации рассчитывается исходя из скорости изменения доли мутантов в культуре, начатой ​​из относительно большой популяции, не содержащей мутантов (17,18). Таким образом, анализы «накопления мутантов» ограничены трудностью создания достаточно больших безмутантных культур, которые обычно требуют наличия фенотипа, связанного с мутационной мишенью.

Хотя в принципе секвенирование может определять скорость мутации независимо от экспрессии фенотипа, флуктуация диктует необходимость анализа многих независимых клонов. Мы исследовали возможность измерения скорости мутации путем прямого секвенирования интересующего гена с течением времени. Предполагая, что каждая пара оснований в данной длине ДНК имеет равную вероятность мутации, независимо друг от друга и почти не имеет шансов мутировать дважды, тогда среднее количество мутаций может быть рассчитано из доли немутантных положений в соответствии с Пуассоновский процесс и / или ряд Тейлора. Эта стратегия уменьшает количество клонов, которые необходимо проанализировать для определения скорости мутации, по сравнению с исследованием изменений фенотипа из-за мутации одной пары оснований.

Мы измерили скорость мутации гена оболочки ВИЧ-1, интегрированного в геном линии В-клеток, в которой скорость спонтанной мутации была строго определена в нескольких локусах (1,19). Поскольку каждая последовательность гена оболочки была получена из консенсуса всех последовательностей, присутствующих в клоне, мы могли исключить из анализа клоны с мутациями-основателями, присутствующими в каждом клоне, тем самым значительно уменьшив колебания количества мутаций. Стратегия требует анализа относительно небольшого числа клонов, если длина секвенированной нуклеиновой кислоты составляет не менее 1 т.п.н., и не зависит от фенотипического анализа; таким образом, его можно распространить на любой локус генома.

МЕТОДЫ

Клетки

Для расчета скорости мутации в гене мы использовали линию В-клеток мышей 18,81, потому что скорость мутации в локусах иммуноглобулина и других локусах была строго определена (1,19). Эта клеточная линия была создана путем нескольких циклов субклонирования клеток костного мозга BALB / c, инфицированных вирусом Абельсона (20,21). Мы выбрали субклон линии клеток 18.81.A3.43 (1). Этот конкретный клон клеток экспрессирует индуцированную активацией цитидиндезаминазу (AID) (22) и претерпевает соматическую гипермутацию (1,22).

Ген интереса

Мы решили измерить скорость мутации экзогенно введенного чужеродного гена, который экспрессируется регуляторными элементами иммуноглобулина. С этой целью мы использовали ген, кодирующий модифицированную версию белка оболочки штамма ВИЧ-1 YU2 (клады B), предоставленный доктором Жоао Гонсалвес (Фармацевтическая школа Лиссабонского университета, Португалия). Этот модифицированный ген оболочки ВИЧ-1 кодирует gp120 и только внеклеточную часть gp41 (чтобы избежать встраивания в мембрану и обеспечить секрецию), продуцируя белок 140 кДа, который мы называем gp140. Ген был модифицирован, как указано Bower et al.(23). Вкратце, ДНК, кодирующая белок gp140, имеет длину 2004 п.н. Он был оптимизирован для эукариотической трансляции путем оптимизации кодонов последовательности, кодирующей белок gp140, и путем замены первых 32 аминокислот белка gp140 лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена. Кроме того, тег из трех копий мышиного C3d (891 п.н. каждая NCBI # >BC043338 нуклеотидов 3058–3948) был добавлен 3 'к gp140 для обеспечения обнаружения вариантов белка, которые могут возникнуть из-за мутации последовательности ВИЧ (24). Полная последовательность имела длину ~ 4,7 т.п.н.

Создание вектора ДНК gp140

Для того, чтобы выразить GP140 гена в клеточной линии B 18.81, легкой цепи иммуноглобулина А , 1 промотор (λ 1 р) направленно клонировали между сайтами HindIII и BamHI в MCS из pcDNA3.1 / Hygro + (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), и сайт рестрикции Nhe1 добавляли на 5'-конец главного интронного энхансера µ тяжелой цепи (Eµ) с помощью ПЦР (с использованием набора праймеров Nhe1Add, см. Ниже). Энхансер был направленно клонирован перед промотором легкой цепи в MCS pcDNA 3.1 между сайтами Nhe1 и HindIII. GP140 сегмент гена был вставлен 3 'к λ 1 р между сайтами BamHI и Xho в MCS из pcDNA3.1. Для этого gp140был переварен EcoRI, заполнен Klenow и переварен Xho1 с образованием 5'-тупого конца и 3'-липкого конца. pcDNA 3.1 была BamHI-рестриктирована и заполнена Klenow для образования 5'-тупого конца с последующей рестрикцией Xho1, генерирующей 3'-липкий конец.

Трансфекция 18,81 B-клеточной линии и клеточной культуры

Чтобы создать стабильную линию В-клеток, экспрессирующую белок gp140, мы электропорировали 2 × 10 7 клеток клона 1B5 линии клеток 18.81.A3.43 (1) при 315 В с 20 мкг вектора gp140 , линеаризованного путем переваривания. с Nru1. Клетки выдерживали в течение 2 дней при 37 ° C в RPMI с 10% FCS, 50 мМ 2-меркаптоэтанола, с пенициллином и стрептомицином (100 Ед / мл) и 2 мМ l-глутамином, добавленными в среду. Через 2 дня трансфицированные клетки отбирали по устойчивости к гигромицину 1 мг / мл. После этого трансфицированные клетки всегда поддерживали в культуре с гигромицином.

Вестерн-блоттинг

Чтобы идентифицировать белок gp140, продуцируемый трансфецированными В-клетками, мы провели вестерн-блоттинг экстрактов клеток. Это было выполнено с помощью PAGE 5–20 мкг клеточного лизата в восстанавливающих условиях (5% 2Mε) на 7,5% Tris – HCl READY GELs (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) с последующим переносом на мембрану Immobilon PVDF (Millipore , Биллерика, Массачусетс, США). На блотах белок gp140 был обнаружен с помощью иммуноглобулина ВИЧ человека (HIVIg) (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Division of AIDS, NIAID, NIH: от NABI и Национального института сердца, легких и крови - от доктора Луиса Барбозы) (1: 3000 –1: 5000), затем коза α человека – HRP (Southern Biotech, Бирмингем, Алабама, США) (1: 2000). C3d детектировали с использованием козьего α-мышиного антитела C3d (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) (1: 1000), а затем кроличьего α-козьего IgG – HRP (Novus Biologicals, Литтлтон, Колорадо, США).

Положительный контроль

Рекомбинантный gp120, полученный в системе бакловируса из штамма YU-2 (Immunodiagnostics, Woburn, MA, USA), использовали в качестве положительного контроля.

Выделение клеточной РНК и ОТ-ПЦР

РНК получали из клеток с использованием набора RNeasy (Qiagen, Hilden, Германия), а кДНК создавали с использованием праймеров oligo dT и системы Thermoscript RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Расчет частоты мутаций

Чтобы обнаружить мутации в гене gp140 , мы исследовали клоны, полученные из одиночных В-клеток. Их создавали, подвергая 18,81 клеток циклам последовательного клонирования путем ограничивающего разведения (1,6 клеток / мл, 100 мкл на лунку в 96-луночных планшетах). Если чашки содержали менее 10 клонов, видимых после 9 дней роста, клоны отбирали и переносили в 4 мл среды и выращивали в течение дополнительных 4 дней. После 13 дней роста клетки в каждом клоне подсчитывали и экстрагировали РНК.

кДНК получали с помощью ОТ-ПЦР и микроглобулина β2 , вариабельную область VH81X , gp140 и ДНК AID амплифицировали с помощью ПЦР (с использованием наборов праймеров β2, VH, gp140-1, gp140-2, AID) с последующей очисткой геля с помощью QIAEXII (Qiagen , Хильден, Германия). Очищенная ДНК, за исключением AID, была напрямую секвенирована по крайней мере четыре раза в центре секвенирования и синтеза ДНК Mayo Clinic. Последовательности выравнивали с помощью программного обеспечения Sequencher (Gene Codes Corporation, Анн-Арбор, Мичиган, США), и оценивали все уникальные мутации, если они не встречались в области праймера и не присутствовали в основателе линии, но присутствовали в дочернем клоне.

Последовательности, полученные путем секвенирования основной кДНК, представляли консенсусную последовательность всех присутствующих клеток, которые выросли из одной отдельной клетки, и, таким образом, представляли последовательность гена в клоне-основателе (при условии, что мутации не произошло при первом или втором делении этих клеток) .

Количество секвенированных пар оснований зависело от анализируемого гена. Для gp140 секвенировали 2000 п.н., так как длина гена составляет 2004 п.н. Для VH81X секвенировали 300 п.н., поскольку это приблизительная длина гена вариабельной области. Наконец, для β2-микроглобулина секвенировали 800 п.н.

В среднем количество клеточных поколений (то есть делений) для любой данной клетки в культуре, которые произошли в течение 13 дней между временем первоначального клонирования и последующим повторным клонированием клеток, рассчитывали путем подсчета клеток в данном клоне. после 13 дней роста и при условии, что все они начинались с одной клетки. Таким образом, если X клетки присутствовали через 13 дней , а количество поколений , которое произошло было п , что число может быть найдено путем решения: 2 п = Х .

Наборы праймеров

Nhe1 Add: 5'-GATC GCTA GCGA GGTC TGGT GGAG CC-3 'и 5'-GGTA TCGA TAAG CTTG ATAT CGAA TTC-3'. β2 5'-TGGC TCGC TCGG TGAC CCTG-3 'и 5'-GCAG AAGT AGCC ACAG GGTT G-3'. VH 5'-GTGC AGCT GGTG GAGT CTGG-3 'и 5'-CCAG AAGT TACC ATAC TAGT C-3'. Gp140 1 5'-CAAT TCGA TATC AAGC TTG-3 'и 5'-TCTC CCAC TGGG TCTT GCTC A-3'. Gp140 2 5'-TGAG CAAG ACCC AGTG GGAG A-3 'и 5'-GATG TACC ACAG CCAC TTGG TG-3'. AID 5'-ATCT CAGA CTGG GACC TGGA C-3 'и 5'-GGAA CCAG AAGT GTCT TCA-3'.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Чтобы определить скорость мутации генов путем прямого секвенирования, мы воспользовались линией В-клеток, в которой известна скорость мутации в нескольких локусах. Эта линия В-клеток, называемая клетками 18.81, была получена путем трансформации мышиных клеток костного мозга BALB / c вирусом Абельсона (20, 21). Субклон 18.81.A3.43 от одной трансформации претерпевает 1,1–4,2 × 10–5 мут / п.н. на поколение клеток в локусах иммуноглобулина (1) и мутирует репортерные гены во многих других локусах с аналогичной скоростью (19). В соответствии со своей способностью мутировать гены Ig, клетки 18,81 экспрессируют мутатор Ig, цитидиндезаминазу, индуцированную активацией (AID).

Чтобы определить, насколько быстро мутирует ген, мы сначала выяснили последовательность гена в клетке-основателе. Для этого мы трансфицировали субклон 18.81.A3.43 геном оболочки вируса иммунодефицита человека-1 ( gp140 ), хорошо охарактеризованным геном (22). Чтобы облегчить обнаружение белков, транслируемых из вариантов gp140 , ген был помечен тремя копиями мышиного C3d. Трансфицированные клетки экспрессировали как РНК гена gp140 (не показано), так и химерный белок gp140C3d (рисунок 1).

GP140 экспрессируется в В-клетках. На фигуре показан вестерн-блот-анализ клеток 18,81, трансфицированных (дорожка 2) или нет (дорожка 1) вектором gp140-C3d. Белковые экстракты получали из 30 × 10 6 клеток и разделяли с помощью 7,5% SDS-PAGE. Белки наносили на мембраны PVDF, и gp140 выявляли с помощью IgG, объединенного и очищенного из человеческой сыворотки ВИЧ-положительных пациентов (HIVIg) в разведении 1: 5000 с последующим конъюгированием козьего антитела против человеческого IgG с HRP в разведении 1: 2000. Химера gp140-C3d имеет приблизительную молекулярную массу 250 кДа.

Чтобы определить скорость мутации, мы провели анализ флуктуаций. Трансфицированные клетки клонировали путем ограничивающего разведения для создания линий клеток (рис. 2). После каждого этапа клонирования РНК экстрагировали из более чем половины клеток в клоне и кДНК, полученную путем обратной транскрипции, ген gp140 амплифицировали с помощью ПЦР и непосредственно секвенировали. Консенсусная последовательность гена gp140 отражала последовательность большинства клеток в клоне и, таким образом, последовательность основателя линии. Посредством последовательных лимитирующих разведений мы получили последовательность гена gp140 в 24 дочерних клетках двух независимых линий. Мы идентифицировали мутации в каждом клоне, сравнивая gp140последовательности в дочерних клетках с последовательностью gp140 в линии-основателе.

Клонирование путем предельного разведения. Трансфицированные клетки 18,81 подвергали последовательным циклам ограничивающего разведения для получения лунок, засеянных одиночными клетками. Из одиночных клеток клоны выращивали в течение 13 дней. Каждое число идентифицирует клон, в котором первые цифры относятся к основателю линии, а следующие цифры представляют субклоны. Например, 18.6.1 относится к клону, полученному от основателя линии 18, который был субклонирован дважды, генерируя первый клон 18.6 и после 18.6.1. Последовательности получали напрямую, без клонирования, из продуктов ПЦР, полученных из кДНК.

Чтобы определить скорость мутации, мы сначала определили вероятность мутации в каждой паре оснований в соответствии с процессом Пуассона. Мы предположили, что каждая мутация отражает независимое событие, которое имеет небольшую вероятность возникновения и бесконечно малую вероятность повторения дважды в одном и том же месте. Таким образом, каждую пару оснований можно рассматривать как независимое испытание Бернулли с результатом либо мутировавшие, либо не мутировавшие, а среднее количество мутаций в клетке можно было бы вычислить с помощью нулевого порядка процесса Пуассона. Средняя частота мутаций ( N 0 / N, где N 0 - количество неизмененных позиций, а N - общее количество секвенированных оснований), таким образом, равнялась e.−λ. В качестве альтернативы, для большого числа N , среднее число мутаций на пару оснований может быть получено 1- N 0 / N . Это потому, что согласно ряду Тейлора e λ = 1 + λ, когда λ мало. Таким образом, e −λ = 1 - λ = N 0 / N , что намного проще вычислить, чем нулевой порядок распределения Пуассона. Использование ряда Тейлора для оценки средней частоты мутаций позволяет легко определить его точность путем вычисления стандартной ошибки оценки, которая равна квадратному корню из средней частоты мутаций, деленному на квадратный корень из N. Число пар оснований для последовательности для получения точной оценки средней частоты мутаций можно вывести из стандартной ошибки.

В одном примере (таблица 1) мы секвенировали 18 000 пар оснований (испытания) и обнаружили семь мутированных пар оснований и 17 993 немутантных пары оснований. Поскольку мутатор Ig в этой конкретной линии нацелен только на пары оснований G / C (5), мы рассчитали скорость, учитывая только количество пар G / C. Следовательно, N 0 = 11 016, N = 11 025 и e - λ = 11 016/11 025. λ = −ln 0,9991836 = 8,1666 × 10 −4. Это число представляет собой среднее количество мутаций на пару оснований (то есть частоту мутаций). Согласно ряду Тейлора средняя частота составляет 8,164 × 10 −4.

Таблица 1.

Количество мутаций в потомстве клона 18

Клон 18 Мутации нет.
18,11
18,30
18,40
18,50
18,63
18,70
18,81
18,92
18.100

Каждый клон был выращен для 22,97 поколений клеток от основателя. Было проанализировано девять клонов, было секвенировано 2000 п.н., содержащих 1225 нуклеотидов G или C, или всего 11025 пар оснований G или C. Оценка средней частоты мутаций на пару оснований была сделана в соответствии с распределением Пуассона, значение нулевого порядка составило - ln (11 016/11 025) = - ln 0,9991836 = 8,1666 × 10 −4. Частота мутаций составляла 3,55 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток. Согласно серии Тейлора, средняя частота составляла 8,164 × 10 -4, что давало такую ​​же частоту мутаций.

Частоту мутаций рассчитывали путем деления средней частоты мутаций на пару оснований на количество поколений клеток. Клон, представленный в таблице 1, вырос из одной клетки до 8,24 × 10 6 клеток до секвенирования. Среднее количество поколений клеток, которые перешли от основателя клона к любой из девяти секвенированных клеток, составило 22,97 (потому что 2 n = 8,24 × 10 6) при условии, что ни одна клетка не погибла. Следовательно, частота мутаций составляла 3,55 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток.

Мы рассчитали скорость мутации в двух других линиях клеток, полученных из той же популяции-основателя. Результаты, представленные в таблице 2, показали скорость 4,65 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток, выведенную из нулевого порядка распределения Пуассона, и скорость 4,69 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток, выведенную из ряда Тейлора. Результаты, представленные в таблице 3, показали, что скорость мутации 1,26 × 10 -5 мутаций / пар оснований на поколение клеток, выведенная из нулевого порядка распределения Пуассона, и скорость 1,39 × 10 -5 мутаций / пар оснований на поколение клеток в соответствии с серией Тейлора. .

Таблица 2.

Количество мутаций в субклоне 18,6

Подклон 18.6 Мутации нет.
18.6.12
18.6.20
18.6.33
18.6.41
18.6.52
18.6.60

Каждый клон был выращен для 23,41 поколения клеток от основателя. Было проанализировано шесть клонов, секвенировано 2000 п.н., содержащих 1225 нуклеотидов G или C, или всего 7350 пар оснований G или C. Оценка средней частоты мутаций на пару оснований была сделана в соответствии с распределением Пуассона, значение нулевого порядка составило - ln (7342/7350) = - ln 0,9989 = 1,089 × 10 −4. Частота мутаций составляла 4,65 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток. Согласно серии Тейлора, средняя частота составляла 1,1 × 10 -3, что давало частоту мутаций 4,69 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток.

Таблица 3.

Количество мутаций в потомстве клона 6

Клон 6 Мутации нет.
6.20
6.32
6.40
6.50
6,60
6,71
6,80
6.90
6.101

Каждый клон был выращен на 28,71 поколений клеток от основателя. Было проанализировано девять клонов, секвенировано 2000 п.н., содержащих 1225 нуклеотидов G или C, или всего 11025 пар оснований G или C. Оценка средней частоты мутаций на пару оснований была сделана в соответствии с распределением Пуассона, значение нулевого порядка составило -ln (11 021/11 025) = -ln 0,9996 = 3,63 × 10 -4. Частота мутаций составляла 1,26 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток. Согласно серии Тейлора, средняя частота составляла 0,4 × 10 -3, что давало скорость мутаций 1,39 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток.

Мутации в гене gp140 нацелены только на пары оснований C и G, и 84% представляют собой переходы (рис. 3), согласующиеся со свойствами мутатора иммуноглобулина в этой клеточной линии (19). Однако мутации в gp140 были рассредоточены по длине гена 2000 п.н. (Рисунок 4). Это распределение контрастирует с типичным распределением мутаций в локусах иммуноглобулина, которые обычно нацелены на первые несколько сотен пар оснований, но простираются на 1,5 т.п.н. ниже по течению (4). Согласитесь, три мутации в экзоне иммуноглобулина VH81X были обнаружены в пределах первых 200 п.н. из 300 секвенированных. Дисперсия мутаций по длине gp140 ген предполагает, что кластеризация мутаций в направлении сайта инициации транскрипции, связанного с мутатором иммуноглобулина в локусе иммуноглобулина, может не сохраняться для других локусов.

Таблица мутаций, отображающая тип мутаций, обнаруженных в гене gp140 . Результаты трех независимых экспериментов.

Схематическое изображение мутаций в генах gp140 и VH81X . Показаны относительное положение и точное количество пар оснований каждой мутации, которая произошла в генах gp140 ( A) или VH81X ( B) во всех секвенированных клонах.

Чтобы рассчитать скорость мутации путем секвенирования, мы предположили, что только одна копия интересующего гена ( gp140в нашем случае) экспрессировалась в каждом анализируемом клоне. Для типичного клеточного гена это разумное предположение. Однако несколько копий гена могут интегрироваться в геном во время трансформации или трансдукции. Однако до тех пор, пока экспрессируется только одна копия гена и экспрессия стабильна, секвенирование кДНК позволит точно оценить скорость мутации. Это связано с тем, что, поскольку мы измеряем скорость мутации путем прямого секвенирования фрагментов амплифицированных генов, полученных из РНК, последовательность отражает консенсус большинства и позволяет избежать ошибок, возникающих во время обратной транскрипции, амплификации или секвенирования. В случае трансгенов с экспрессией только одной копии последовательность, полученная таким образом, отражает последовательность гена. В случае генов, которые экспрессируются из двух копий,как и в случае большинства клеточных генов, мутация в одной из копий, но не в другой, вызовет неоднозначное прочтение в этой позиции, которое может быть разрешено клонированием. В качестве альтернативы селективная амплификация одной из копий (с использованием преимуществ известных полиморфизмов) позволит однозначно обнаруживать мутации путем прямого секвенирования.

Чтобы проверить наш метод, мы измерили скорость мутации гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина в клетках 18,81 и сравнили результат с предыдущими оценками (1). Мы секвенировали 300 п.н. вариабельной области иммуноглобулина VH81X из каждого клона, содержащего 176 G или C нуклеотидов, и идентифицировали мутации, как описано. Мы не обнаружили мутаций в девяти дочерних клетках линии 18, двух мутациях в шести дочерних клетках линии 18.6 (Таблица 4 и Рисунок 4 B) и одной мутации в девяти дочерних клетках линии 6 (Таблица 5 и Рисунок 4 B). Скорость мутации составляла 8,1 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток или 8,54 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток, в соответствии с процессом Пуассона или серией Тейлора, соответственно. Скорость мутации в линии 6 (таблица 5 и рисунок 4 B) составляла 2,2 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток или 3.5 × 10 -5 mut / bp на поколение клеток, согласно процессу Пуассона или серии Тейлора, соответственно. Следовательно, скорость мутации в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина имеет тот же порядок величины, что и скорость, рассчитанная для гена оболочки ВИЧ-1.

Таблица 4.

Количество мутаций в потомстве субклона клона 18

Подклон 18.6 Мутации нет.
18.6.10
18.6.20
18.6.30
18.6.40
18.6.52
18.6.60

Каждый клон был выращен для 23,41 поколения клеток от основателя. Было проанализировано шесть клонов, секвенировано 300 п.н., охватывающих 176 G или C нуклеотидов, или всего 1056 пар оснований G или C. Оценка средней частоты мутаций на пару оснований была сделана в соответствии с распределением Пуассона, значение нулевого порядка составило -ln (1054/1056) = -ln 0,998 = 1,90 × 10 -3. Частота мутаций составляла 8,1 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток. Согласно серии Тейлора, средняя частота составляла 2 × 10 -3, что давало частоту мутаций 8,54 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток.

Таблица 5.

Количество мутаций в потомстве клона 6

Клон 6 Мутации нет.
6.20
6.30
6.40
6.50
6,60
6,71
6,80
6.90
6.100

Каждый клон был выращен на 28,71 поколений клеток от основателя. Было проанализировано девять клонов, 300 п.н., 176 нуклеотидов, содержащих G или C, секвенировали на клон, или всего 1584 пары оснований G или C. Оценка средней частоты мутаций на пару оснований была сделана в соответствии с распределением Пуассона, значение нулевого порядка составило -ln (1583/1584) = -ln 0,999 = 6,32 × 10 -4. Частота мутаций составляла 2,2 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток. Согласно серии Тейлора, средняя частота составляла 1 × 10 -3, что давало частоту мутаций 3,5 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток.

Мы подтвердили скорость мутации в субклоне 18.81.A3.43, выполнив классический анализ флуктуаций. Мы использовали иммунофлуоресценцию для идентификации клонов с клетками, экспрессирующими тяжелую цепь µ иммуноглобулина, и клонов без клеток, экспрессирующих тяжелую цепь µ. Поскольку реверсия янтарного STOP-кодона посредством мутации одного нуклеотида делает возможной экспрессию тяжелой цепи иммуноглобулина μ, скорость реверсии равна скорости мутации. В среднем мы нашли 1,442 ревертанта на клон при нулевом порядке распределения Пуассона. Скорость реверсии рассчитывалась путем деления средней частоты реверсии на среднее количество клеток в каждом клоне и на общее количество поколений клеток в истории клона (26). Частота реверсии составила 7.2 × 10 -6 мутаций / п.н. на поколение клеток и, по крайней мере, на порядок ниже, чем скорость мутации, измеренная с помощью секвенирования. Поскольку мутанты были идентифицированы по экспрессии тяжелой цепи μ, обнаружение может быть нарушено из-за фенотипического запаздывания, то есть задержки между возникновением мутации и экспрессией белка.

Чтобы определить, мутируют ли консервативные гены также в клетках 18,81, мы секвенировали ген β2-микроглобулина в каждом из клонов, которые, как было обнаружено, мутируют ген gp140 . Ген микроглобулина β2 является высококонсервативным (27) и, как известно, не мутирует в В-клетках. Мы не обнаружили мутаций в 800 п.н. гена микроглобулина β2 ни в одном из исследованных клонов (данные не показаны). Эти результаты показывают, что секвенирование не привело к искусственному возникновению мутаций и что ген микроглобулина β2 мутирует со скоростью ниже 2,6 × 10 -6 мутаций / п.н. на поколение клеток (приблизительная скорость мутации, если была обнаружена только одна мутация). Этот показатель ниже, чем для gp140. гена и гена иммуноглобулина (1), что указывает на то, что в соответствии с выводами других авторов (28) соматическая гипермутация не нацелена на все локусы в геноме В-клеток.

Здесь мы показываем, что скорость мутации гена может быть измерена прямым секвенированием независимо от фенотипической экспрессии репортерного гена. Этот подход может быть применен к любой области генома и даже к различным областям в пределах одного гена и может быть выполнен за относительно короткое время. Мы показываем, что скорость мутации белка оболочки ВИЧ-1, интегрированного в геном мутирующей линии В-клеток, составляет от 1,26 × 10 -5 до 3,55 × 10 -5 мутаций / п.н. на поколение клеток и в том же диапазоне, что и скорость мутации гена иммуноглобулина (1).

ФИНАНСИРОВАНИЕ

NIH (HL079067); Фонд Билла и Мелинды Гейтс (52090). Финансирование платы за открытый доступ: NIH и Фонд Билла и Мелинды Гейтс.